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EnemarkJeremy TH.Chang, Shibai Li, … Shixin LiuJiangchuan Shen, Yiling Zhao, … Hengyao NiuNature Band 609, Seiten 630–639 (2022) Zitieren Sie diesen ArtikelDie Holliday-Verbindung ist ein Schlüsselintermediat, das während der DNA-Rekombination in allen Reichen des Lebens gebildet wird1.In Bakterien wird die Holliday-Verbindung von zwei homohexameren AAA+-ATPase-RuvB-Motoren prozessiert, die sich mit dem RuvA-Holliday-Verbindungskomplex zusammenfügen, um die Strangaustauschreaktion mit Energie zu versorgen2.Trotz seiner Bedeutung für die Chromosomenerhaltung sind die Struktur und der Mechanismus, durch den dieser Komplex die Verzweigungsmigration erleichtert, unbekannt.Hier haben wir mit zeitaufgelöster Kryoelektronenmikroskopie Strukturen des ATP-hydrolysierenden RuvAB-Komplexes in sieben verschiedenen Konformationszuständen erhalten, die während des Zusammenbaus und der Verarbeitung einer Holliday-Verbindung aufgenommen wurden.Fünf Strukturen lösen zusammen den vollständigen Nukleotidzyklus auf und offenbaren die räumlich-zeitliche Beziehung zwischen ATP-Hydrolyse, Nukleotidaustausch und kontextspezifischen Konformationsänderungen in RuvB.Koordinierte Bewegungen in einem Konverter, der aus DNA-freigesetzten RuvB-Untereinheiten besteht, stimulieren die Hydrolyse und den Nukleotidaustausch.Durch die Immobilisierung des Konverters kann RuvB die im ATP enthaltene Energie in eine Hebelbewegung umwandeln, die die Zugkraft erzeugt, die die Astwanderung antreibt.Wir zeigen, dass RuvB-Motoren zusammen mit dem DNA-Substrat rotieren, das zusammen mit einem fortschreitenden Nukleotidzyklus die mechanistische Grundlage für die DNA-Rekombination durch kontinuierliche Verzweigungsmigration bildet.Zusammen entschlüsseln unsere Daten die molekularen Prinzipien der homologen Rekombination durch den RuvAB-Komplex, klären diskrete und sequentielle Übergangszustands-Zwischenprodukte für die chemo-mechanische Kopplung von hexameren AAA+-Motoren auf und liefern eine Blaupause für das Design von zustandsspezifischen Verbindungen, die auf AAA+-Motoren abzielen.Homologe Rekombination ist ein grundlegender zellulärer Prozess, der an der Aufrechterhaltung der genetischen Integrität und der Erzeugung genetischer Vielfalt in allen Bereichen des Lebens beteiligt ist.Das zentrale und universelle Element bei der genetischen Rekombination sowie bei der Reparatur von Doppelstrangbrüchen und im Prozess der Rettung der Replikationsgabel ist ein Vier-Wege-DNA-Heteroduplex namens Holliday Junction1,3,4.In Prokaryoten spielen die beiden Proteine ​​RuvA und RuvB eine entscheidende Rolle bei der Verarbeitung der Holliday-Verbindung, indem sie die ATP-abhängige unidirektionale Strangaustauschreaktion fördern, die als aktive Zweigmigration bekannt ist2,5,6,7,8,9,10,11.Frühere biochemische und strukturelle Beweise deuten darauf hin, dass die Verzweigungsmigration durch einen dreiteiligen Komplex erleichtert wird: RuvA-Tetramere ordnen sich um die Kreuzung der Holliday-Verbindung an, um eine strukturelle Führung für die DNA-Trennung und das Zurückspulen bereitzustellen, und werden von zwei hexameren RuvB-AAA+-ATPasen flankiert, die zusammen die Translokation des Neuen antreiben entstand rekombinierte DNA12,13,14,15,16,17,18,19.Darüber hinaus zeigten diese Studien, dass Domäne III von RuvA (RuvAD3) an die Präsensor-1-β-Haarnadel von RuvB bindet, ein Unterscheidungsmerkmal der PS1-Insert-Superklasse20,21, die Zweigmigration reguliert und die ATPase-Aktivität des RuvB-Motors erhöht22,23.Darüber hinaus begründete die Fähigkeit zur speziesübergreifenden Heterokomplementation die Existenz eines robusten und konservierten Mechanismus der RuvA- und RuvB-AAA+-koordinierten Wirkung an der Holliday-Verbindung24,25.Trotz des umfangreichen Wissens sind die Struktur des RuvAB-Holliday-Junction-Komplexes (im Folgenden als RuvAB-HJ bezeichnet) und die molekularen Mechanismen, durch die die RuvB-AAA+-Motoren die Translokation von DNA antreiben, um einen der grundlegendsten biologischen Prozesse in zu erleichtern lebende Organismen – nämlich die Aufrechterhaltung und der Austausch genetischer Informationen26,27 – bleiben unbekannt.Um die Architektur zu entschlüsseln und die Funktionsprinzipien der RuvAB-Maschinerie zu entschlüsseln, haben wir zeitaufgelöste Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) und Einzelpartikelanalysen von in vitro rekonstituierten RuvAB-Komplexen angewendet, die eine Holliday-Verbindung verarbeiten.Unsere Strukturanalysen zeigen eine hochgradig koordinierte Konformationslandschaft eines aktiven RuvAB-Verzweigungsmigrationskomplexes und decken das dynamische Zusammenspiel zwischen einem vollständig aufgelösten Nukleotidzyklus in einem rotierenden RuvB-AAA+-Motor sowie DNA-Translokation auf.Darüber hinaus zeigen wir, dass RuvB-Motoren die DNA als molekulare Hebel in einem ATP-abhängigen Krafthub verschieben, um chemische Energie in mechanische Kraft umzuwandeln.Die von der RuvAB-Maschinerie angetriebene Verzweigungsmigration von Holliday-Verbindungen ist ein schneller und hochdynamischer Prozess, der während der DNA-Rekombination wesentlich ist28,29 (Abb. 1a).Um diesen Prozess zu visualisieren, haben wir RuvAB-HJ-Komplexe in vitro aus einzeln gereinigten Komponenten rekonstituiert, die von Salmonella typhimurium bzw. Streptococcus thermophilus stammen, und ihre Funktion in einem Zweigmigrationsassay getestet (Abb. 1b).Sowohl Homo- (RuvA und RuvB von S. typhimurium) als auch Hetero- (RuvA von S. typhimurium und RuvB von S. thermophilus) prozessierten die Holliday-Verbindung ähnlich nach Zugabe von ATP, was auf einen stark konservierten zugrunde liegenden Mechanismus aufgrund der Austauschbarkeit hindeutet Einzelkomponenten (Abb. 1b und Erweiterte Daten Abb. 1a–h).Um die katalytischen Schritte dieses schnellen Prozesses zu erfassen, verlangsamten wir zunächst die Reaktion, indem wir ATP durch eine äquimolare Mischung aus dem langsam hydrolysierbaren ATPγS30 und ADP ersetzten, und inkubierten die Reaktion auf Eis entweder für 30 min (Datensatz t1) oder für 5 h (Datensatz t2), um eine Initiations- und eine Äquilibrierungsphase des RuvAB-HJ-Komplexes nachzuahmen (erweiterte Daten, Abb. 1h).Die anschließende Vitrifikation von Proben führte bei Homokomplexen zu Aggregaten und einer geringen Anzahl einzelner Partikel, während die Verteilung von Heterokomplexen über das Gitter weitgehend monodispers und für die Einzelpartikelanalyse geeignet war (erweiterte Daten, Abb. 1f–j).Die Kryo-EM-Struktur des RuvAB-HJ-Komplexes mit einer Auflösung von 8 Å zeigte hochflexible und linear angeordnete dreiteilige Anordnungen mit acht RuvA-Molekülen, die symmetrisch in zwei Tetrameren angeordnet sind (Auflösung von 3,3 Å), und flankiert von der Vierwege-Holliday-Verbindung , und flexibel verbunden mit einem oder zwei RuvB-Hexameren (Auflösung von 2,9–4,1 Å) sowie bipartiten Partikeln (Auflösung von 3,9 Å) (Abb. 1c–e und Erweiterte Daten Abb. 2a–c, 3a–d und 4a– b und erweiterte Datentabelle 1).Diese Architektur stimmt mit früher vorgeschlagenen Modellen der RuvAB-Maschinerie14,15,17,22,23,31 überein.Bei beiden Partikeltypen tritt die DNA als Doppelhelix in den RuvA-Kern ein und aus, wobei ein oder zwei hexamere RuvB-Motoren in die kleine Furche der wieder verbundenen DNA eingreifen (Abb. 1f).Der RuvA-Kern ist physisch mit beiden RuvB-Motoren über RuvAD3 verbunden (Abb. 1c).Auf beiden Seiten sind zwei RuvAD3-Domänen an benachbart positionierte RuvB-Untereinheiten gebunden, was darauf hindeutet, dass diese Domänen kooperieren könnten, um die beiden RuvB-AAA+-Motoren zu steuern (Abb. 1c, e).Bemerkenswerterweise lokalisieren sich alle vier RuvB-koordinierenden RuvAD3-Domänen auf derselben Seite des Crossovers der Holliday-Verbindung (erweiterte Daten, Fig. 4f), was impliziert, dass ein einzelnes RuvA-Tetramer ausreichen könnte, um beide RuvB-Motoren gleichzeitig zu betreiben.Diese Ergebnisse stimmen auch mit der vorgeschlagenen Architektur des RuvABC-Resolvasoms überein, bei dem angenommen wird, dass die Holliday-Verbindung sandwichartig von einem RuvA-Tetramer und einem Dimer der Resolvase RuvC32,33 eingeschlossen ist (erweiterte Daten, Fig. 4g).a, Schematische Darstellung der Holliday-Junction-Zweigmigration.HJ, Holliday-Kreuzung.b, RuvAB-Homo- und -Heterokomplexe sind für die Verzweigungsmigration aktiv.Vergleich der Aktivität unter Verwendung von fluoreszenzmarkiertem Holliday Junction (8 nM) rekombinantem S. typhimurium RuvA (60 nM) und rekombinantem RuvB, das entweder aus S. typhimurium (160 nM) (homo) oder S. thermophilus (160 nM) (hetero) stammt.Die Versuche wurden dreimal wiederholt.P, Produkt.c, Kryo-EM-Kompositkarte des RuvAB-Komplexes (Molekulargewicht ungefähr 650 kDa), der an die Holliday-Verbindung gebunden ist.Die absolute RuvA:RuvB-Stöchiometrie beträgt 8:12.Zwei RuvA-Tetramere (hellblau (vorne) und oliv (hinten)) schließen die Holliday-Kreuzung ein.Die C-terminalen RuvAD3-Domänen erstrecken sich vom zentralen Kern und binden an den RuvB-Motor.d, RuvAB-HJ-Partikel sind hochflexibel.Repräsentative 2D-Klassen von dreiteiligen (1) und zweiteiligen (2) Partikeln.Fokussierte Klassifikationen auf einen der RuvB-Motoren (3) oder den zentralen RuvA-HJ-Kern (4) unterstreichen die Gesamtflexibilität von dreiteiligen Partikeln.Maßstabsbalken, 10 nm.e, RuvB-Motoren binden an eine oder zwei RuvAD3-Domänen (blau).Die beiden RuvAD3-Domänen binden an benachbarte RuvB-Untereinheiten in den RuvB-Motoren.f, RuvAB-HJ-Komplex, in dem vom Substrat gelöste RuvB-Untereinheiten und ein RuvA-Tetramer entfernt wurden, um die Holliday-Verbindung und die Wechselwirkung jedes RuvB-Motors mit seinem verwandten DNA-Substrat sichtbar zu machen.Pfeile zeigen die Bewegungsrichtung der DNA am Eingang zum RuvA-Kern und am Ausgang des neuen DNA-Duplex aus den RuvB-Motoren.Die Abmessungen des Komplexes sind angegeben.g, Konfiguration von RuvB-Hexameren, die eine Drehung um 60° relativ zum RuvA-Kern erfahren.Fokussierte 3D-Klassen (End-on- (oberes Bild) und Seitenansichten (unteres Bild) unter Verwendung einer Maske, die einen RuvB-Motor und den zentralen RuvA-Kern umschließt. Interagierende RuvAD3-Domänen sowie konformationsspezifische RuvB-Untereinheiten sind um 60 ° in Bezug auf gedreht der RuvA-HJ-Kern.Um die Flexibilität von RuvAB-HJ-Komplexen zu untersuchen, unterzogen wir unsere Partikel weiteren dreidimensionalen Klassifizierungen.Diese Analyse ergab, dass neben der Gesamtflexibilität bei etwa 7 % der zweiteiligen Partikel und etwa 6 % der dreiteiligen Partikel die Position von DNA-engagiertem RuvB in Bezug auf den RuvA-HJ-Kern um etwa 60° gedreht ist.Dies deutet darauf hin, dass sich die RuvB-Motoren drehen können und dass jede RuvB-Untereinheit nach Abschluss einer Drehung um 60 ° die Position einnimmt, die vor der Drehung von ihrem Nachbarn eingenommen wurde (Abb. 1g, Erweiterte Daten Abb. 5a, b und Zusatzvideo 1). .Die Rotation wird ferner durch Mehrkörper-Verfeinerungsanalyse belegt, in der sie etwa 45 % der Gesamtflexibilität in den Partikeln ausmacht (erweiterte Daten, Abb. 5c–e und ergänzendes Video 2).Daher schlussfolgerten wir, dass der rekonstituierte RuvAB-Komplex enzymatisch aktiv ist und daher in unterschiedlichen Konformationszuständen abgebildet wurde.Darüber hinaus zeigen unsere Daten, dass die zuvor beschriebene kontinuierliche Rotation der DNA-Substrate34 von einer gleichzeitigen Rotation der RuvB-AAA+-Motoren selbst begleitet wird.Um zu verstehen, wie die Rotation des RuvB-Motors mit der Zweigmigration verbunden ist, haben wir eine iterative fokussierte Verfeinerung zusammen mit einer strengen dreidimensionalen Klassifizierung auf die RuvB-Hexamere aus unserem t2-Datensatz angewendet.Diese Analyse ergab 9 strukturell unterschiedliche RuvB-Motorkarten mit Auflösungen zwischen 2,9 und 4,1 Å (Erweiterte Daten, Abb. 2c, e und 3e–n und erweiterte Datentabelle 1).Zwei dieser Karten (bei 3,9 und 4,1 Å Auflösung) konnten nicht auf eine Auflösung verbessert werden, die eine eindeutige Zuordnung von Nukleotiden erlauben würde und wurden daher nicht weiter betrachtet.Die verbleibenden sieben RuvB-Motoren können nach der Anzahl der gebundenen RuvAD3 gruppiert werden, wobei eine Karte kein RuvAD3 enthält (s0−A), zwei Karten eine RuvAD3 enthalten (s0 und s1) und vier Karten zwei gebundene RuvAD3-Domänen (s2, s3, s4 und s5), was zusammen auf ein dynamisches Zusammenspiel zwischen RuvAD3 und den RuvB-Motoren hindeutet.Alle RuvB-Motoren bauen sich zu geschlossenen, asymmetrischen Hexameren zusammen, die eine etwa 2 nm breite zentrale Pore aufweisen, die die DNA aufnimmt (erweiterte Daten, Abb. 3e–m).In Übereinstimmung mit früheren Struktur- und Interaktionsstudien wird die RuvB-Oligomerisierung durch die großen (RuvBL) und kleinen (RuvBS) ATPase-Domänen benachbarter Untereinheiten vorangetrieben18,19,35 (Erweiterte Daten, Abb. 4c–e).Ähnlich wie bei anderen AAA+-Translokasen36,37,38,39 bauen sich vier RuvB-Untereinheiten (A, B, C und D) zusammen zu einer „Wendeltreppe“ zusammen.Dies erzeugt eine kontinuierliche Schnittstelle, die hauptsächlich einen der beiden DNA-Stränge bindet (Abb. 2a, b), was hervorhebt, dass nur ein Strang jeder doppelsträngigen DNA, die in den RuvA-Kern eintritt, von einem RuvB-Motor gehalten wird (Erweiterte Daten, Abb. 4h). .Die beiden verbleibenden RuvB-Untereinheiten (E und F) schließen die Wendeltreppe, binden aber nicht an die DNA.Die DNA-engagierten Untereinheiten (A, B, C und D) binden die DNA über ihre C-terminalen Kopfdomänen (RuvBH).Jede RuvBH-Domäne enthält vier konservierte Argininreste Arg291, Arg310, Arg312 und Arg315, die eine positiv geladene Bindungsschnittstelle erzeugen, die komplementär zum negativ geladenen DNA-Rückgrat ist (Abb. 2c, d).(Um den Vergleich mit dem Escherichia coli RuvAB-System zu erleichtern, sind die entsprechenden Rückstände in den Zusatzinformationstabellen 1 und 2 aufgeführt).Das wiederholte Bindungsmuster der Argininreste, die von jeder der Untereinheiten stammen, greift in die DNA ein, die durch den Abstand von zwei Nukleotiden (ungefähr 7 Å) getrennt ist.Da die RuvB-Untereinheiten im RuvB-Hexamer etwa 60° voneinander entfernt positioniert sind, implizieren diese Daten außerdem, dass die Rotation der RuvB-Motoren mit den Ereignissen verknüpft ist, die innerhalb eines Translokationsschritts auftreten.a, Schematische Darstellung der Grenzfläche zwischen dem DNA-Substrat und den vier treppenförmigen RuvB-Untereinheiten (A, B, C und D).Die Untereinheiten greifen in das DNA-Substrat entlang des Phosphatrückgrats von nur einem DNA-Strang ein, der entlang der DNA-Achse einen Abstand von etwa 7 Å hat (alle zwei Nukleotide).b, Kryo-EM-Karte, die die Bildung einer Wendeltreppe durch die DNA-interagierenden Untereinheiten (A, B, C und D) hervorhebt (in dieser Ansicht sind die Untereinheiten E und F, die die DNA nicht binden, entfernt).c, Oberflächenladungsdarstellung der Kopfdomänen der DNA-bindenden Grenzfläche, die durch die RuvB-Treppe gebildet wird (A, B, C und D).d, Die Wendeltreppe bildet eine positiv geladene Spalte, die aus Argininresten (Arg291, Arg310, Arg312 und Arg315) von A nach D besteht, um einen Strang der doppelsträngigen DNA zu binden.e, Oberflächendarstellung und Variabilitätsanalyse von RuvB.Die Analyse teilt das RuvB-Hexamer in einen starren (weißen) und einen flexiblen (stahlblauen) Bereich, verbunden durch die Grenzuntereinheiten A und D. Färbung gemäß der Standardabweichung des Abstands von Cα-Atomen (atomare Modelle wurden an der RuvB-Untereinheit ausgerichtet C).f, Überlagerung von 30 RuvB-Untereinheiten, extrahiert aus den fünf hexameren RuvB-Motorzuständen (s1 bis s5).RuvB-Untereinheiten wurden an der Kopfdomäne von RuvB ausgerichtet.Farbige Markierungen repräsentieren ähnliche Konformationen (Konformationscluster [A] bis [F]).Um die gesamte konformative Plastizität des Hexamers zu untersuchen, analysierten wir die Variabilität für jedes Cα-Atom über alle sieben unterschiedlichen Motorstrukturen, ausgedrückt als Standardabweichung der Abstände zu ihren entsprechenden Schwerpunkten (Abb. 2e).Dabei zeigte sich, dass das RuvB-Hexamer in starre (weiß), flexible (blau) und intermediäre Regionen unterteilt werden kann.Während der starre Bereich die DNA-gebundenen Untereinheiten B und C enthält, befinden sich die DNA-abgelösten Untereinheiten E und F im flexiblen Teil.Bemerkenswerterweise befinden sich die DNA-gebundenen Untereinheiten A und D, die die beiden ungleichen Hälften am oberen bzw. unteren Ende der Treppe verbinden, in Zwischenregionen, was darauf hindeutet, dass die unterschiedliche Flexibilität innerhalb des Hexamers an der RuvAB-vermittelten Verzweigung beteiligt ist Migration.Zu beachten ist, dass das Ausmaß der Variabilität nicht notwendigerweise auf eine ganze RuvB-Untereinheit beschränkt ist, wie dies beispielhaft für die Untereinheiten A und D gezeigt wird, die sowohl flexible als auch starre Bereiche aufweisen (Abb. 2e).Um die Plastizität einzelner RuvB-Untereinheiten weiter zu beurteilen, bestimmten wir die durchschnittliche mittlere quadratische Abweichung (RMSD) zwischen den 42 RuvB-Untereinheiten und auch zwischen ihren einzelnen Domänen: RuvBL (Reste 21–181), RuvBS (Reste 182–254) und RuvBH (Reste 255–330).Diese Analyse ergab einen niedrigen durchschnittlichen rmsd (rmsdØ 1,2 Å, 0,48 Å bzw. 0,453 Å) für jede Domäne (erweiterte Daten, Abb. 6a), was zeigt, dass die Gesamtstrukturen von RuvBL, RuvBS und RuvBH weitgehend konstant bleiben, ihre Position jedoch relativ zu voneinander variieren (Abb. 2f und Erweiterte Daten Abb. 6a,b).Das Vorhandensein des DNA-Substrats innerhalb des Hexamers ermöglichte uns ferner zu bestimmen, dass RuvB-Untereinheiten positionsspezifische, unterschiedliche Konformationen aufweisen, die im Folgenden als Cluster bezeichnet werden (wobei Cluster [A] der Position von Untereinheit A in RuvB entspricht, Cluster [ B] entsprechend der Position der Untereinheit B usw.) (Abb. 2f).Wir haben dann die strukturelle Plastizität innerhalb von RuvB-Clustern von Zustand s1 bis s5 quantifiziert, indem wir zwei Diederwinkel (d1 zwischen RuvBL und RuvBS und d2 zwischen RuvBS und RuvBH) und einen Dreieckswinkel gemessen haben, was eine ganzheitlichere Sicht auf die in RuvB auftretenden Änderungen bietet (Erweiterte Daten Fig. 6c).Wir fanden heraus, dass jeder der RuvB-Cluster ([A] bis [F]) durch eine einzigartige Kombination der drei Winkel gekennzeichnet ist und somit einen Satz von RuvB-Untereinheiten mit ähnlicheren Konformationen enthält (Abb. 3a).RuvB unterliegt auch einer Verformung innerhalb von Clustern und ist am variabelsten in Cluster [E], in dem der Dreieckswinkel einen dynamischen Bereich von 5,6 ° abdeckt (Abb. 3a und Erweiterte Daten Abb. 6c).Um die Bewegungen in diesem flexiblen Bereich des RuvB-Hexamers besser zu charakterisieren, haben wir die fünf Strukturen s1 bis s5 an der fast unveränderlichen Untereinheit C ausgerichtet und die Bewegungen aller anderen Untereinheiten analysiert (erweiterte Daten, Abb. 6d–f).Dieser Ansatz zeigte, dass sequentielle Konformationsänderungen innerhalb des Clusters [E] entlang einer Trajektorie mit einer durchschnittlichen Länge von etwa 7 Å (Bereich: 6–10 Å) beschrieben werden können, die auf den RuvA-HJ-Kern gerichtet ist (Abb. 3b).Bemerkenswerterweise entspricht die Länge der Trajektorie innerhalb des Clusters [E] gut der Schrittweite der RuvB-Treppe von zwei Nukleotiden (der Abstand zwischen Nukleotiden in DNA beträgt ungefähr 3,5 Å), was darauf hindeutet, dass die fünf RuvB-Strukturen (s1 bis s5) dies könnten stellen aufeinanderfolgende atomare Schnappschüsse eines aktiven RuvB-Motors dar, während er einen Translokationsschritt durchläuft.a, Analyse von Konformationsclustern von RuvB-Untereinheiten von Zustand s1 bis s5 unter Verwendung von Dieder- (d1 und d2) und Dreieckswinkeln (erweiterte Daten, Abb. 6).Spalten repräsentieren den Dreieckswinkel einzelner RuvB-Untereinheiten über die Bundesstaaten hinweg.b, Unidirektionale Trajektorie (Pfeil) der Untereinheiten im Cluster [E], die eine Distanz von etwa 7 Å zurücklegt.RuvB-Hexamere wurden der Untereinheit C im starren Bereich des Hexamers überlagert.c, Nukleotidbelegung aller RuvB-Untereinheiten innerhalb von Hexameren in den Zuständen s1 bis s5.ATP-Hydrolyse und Nukleotidaustausch finden ausschließlich in Cluster [A] bzw. [D] statt und folgen einer Chronologie von Ereignissen (rote Pfeile), beginnend mit ADP-Freisetzung (Cluster [D], s1→s2), ATP-Hydrolyse (Cluster [A ], s2→s3→s4) und ATP-Aufnahme (Cluster [D], s4→s5).Hinweis: Die Korrelation dieser Reihenfolge von Ereignissen führt zu der in b gezeigten Konformationsbahn.d, Bereiche konformativer Plastizität des RuvB-Hexamer-Übergangs durch die Zustände s1 bis s5, gemessen als rmsd der Cα-Atome zwischen zwei aufeinanderfolgenden RuvB-Motorzuständen.Alle Zustände wurden an der DNA ausgerichtet (grün, hellgrün).Als Referenz ist die Untereinheit E in Draufsicht und Unteransicht skizziert.e, Schema, das die relativen Richtungen der Progression um den Ring des Nukleotidzyklus (orange) und die DNA-Rotation zusammen mit RuvB (blau) zeigt.Rechts, repräsentative Kryo-EM-Dichten innerhalb der Nukleotidbindungstaschen und modellierte Nukleotide für ATPγS, ADP und Apo.f, ATP-nicht-hydrolysierende Nukleotidbindungstasche.Überlagerung der Schnittstellen, die die Nukleotidbindungstasche der Untereinheit A (trans) und B (cis) von s1 bis s5 bilden.Die Ligandentasche bleibt weitgehend invariant.g, Die ATP-hydrolysierende Nukleotid-Bindungstasche: Überlagerung der Grenzflächen, die die Nukleotid-Bindungstasche bilden, zwischen Untereinheit A (cis) und F (trans) von s1 bis s5.Die α-Helices α4 und α5 in der Untereinheit F werden allmählich verdrängt, was zur ATP-Hydrolyse führt.h, Vergrößerung hebt die unmodellierte Kryo-EM-Dichte (grüne Dichte) im Zustand s2 hervor, die wahrscheinlich geordneten Wassermolekülen entspricht, die den nukleophilen Angriff auf das ATP-γ-Phosphat einleiten.Um die Wechselwirkung zwischen den beobachteten Konformationsänderungen in RuvB-Hexameren und der ATP-Hydrolyse zu untersuchen, analysierten wir zunächst die Nukleotididentität und -belegung für alle dreißig Nukleotidbindungstaschen (erweiterte Daten, Abb. 7a, b).Wir fanden heraus, dass Cluster [A], das sich am oberen Ende der Treppe befindet, entweder ATPγS (s1 und s2), ADP + Mg2+ (s3) oder ADP (s4 und s5) enthält, eine Konfiguration, die mit einem fortschreitenden ATP übereinstimmt Hydrolysereaktion an dieser Tasche.Auf der gegenüberliegenden unteren Seite des Hexamers enthält Cluster [D] entweder ADP (s1), fragmentierte und unterbrochene Dichten (s2 bis s4) oder ATPγS (s5).Die fragmentierten und unterbrochenen Dichten weisen auf eine geringe Nukleotidbelegung hin, was darauf hindeutet, dass diese Stellen eine Apo-ähnliche Konfiguration aufweisen.Die DNA-gebundenen Cluster [B] und [C] sind ausschließlich von ATPγS besetzt, im Gegensatz zu den DNA-freigesetzten Clustern [E] und [F], die nur ADP gebunden haben (Abb. 3c).Unabhängig von der vorherigen Ordnung auf der Grundlage von Konformationsänderungen entlang einer Trajektorie offenbarte der Nukleotidzyklus der fünf Zustände die gleiche Abfolge von Strukturzuständen (s1→→s5) und bestätigt damit unabhängig ihre Ordnung: Der Zyklus beginnt mit der ADP-Freisetzung in Untereinheit D (s1→s2), gefolgt von der katalytischen Reaktion durch drei Zustände in Untereinheit A (ATP→ADP + Mg2+→ADP (s2→s3→s4)) und wird durch ATP-Aufnahme in Untereinheit D (s5) abgeschlossen (Abb. 3d).Diese Daten zeigen, dass ATP-Hydrolyse und Nukleotidaustausch in gegenüberliegenden Clustern stattfinden, die sich oben [A] bzw. unten [D] der Treppe befinden, und einzelne Schritte räumlich und zeitlich getrennt sind (Abb. 3c – e).Die Notwendigkeit einer strukturellen Kohäsion, um zwischen gegenüberliegenden Untereinheiten zu zirkulieren, und die gleichzeitigen oben beschriebenen Konformationsänderungen legen nahe, dass es eine ineinandergreifende Signalkette zwischen den Untereinheiten gibt, die den Nukleotidzyklus und letztendlich die DNA-Translokation verbindet.Bemerkenswerterweise bleibt die DNA über alle fünf Zustände hinweg an alle vier Treppenuntereinheiten (A bis D) gebunden und somit ist die Wechselwirkung des DNA-Substrats mit diesen Untereinheiten unabhängig von der Art des gebundenen Nukleotids, einschließlich bei der ATP-Hydrolyse (Untereinheit A) und an der Austauschposition (Untereinheit D) (Erweiterte Daten Fig. 7c).Folglich zeigen unsere Daten, dass, um das DNA-Substrat innerhalb der zentralen RuvB-Motorpore zu verlagern, die RuvB-Untereinheiten zusätzlichen Konformationsänderungen unterliegen müssen, die dem Nukleotidzyklus folgen.Wir schlussfolgern daher, dass der Nukleotidzyklus tatsächlich dazu dient, zuerst die RuvB-Untereinheiten über fünf Zustände zu primen, um dann die Konformationen ihrer jeweiligen benachbarten Cluster zu erwerben (erweiterte Daten, Fig. 6f).Dafür spricht auch die Tatsache, dass die Nukleotidanordnung im Zustand s5 der gleichen Konfiguration wie im Zustand s1 entspricht, die jeweiligen Konformationen der sechs Untereinheiten jedoch um eins nach vorne verschoben sind, um den neuen Nachfolgezustand zu besetzen (s5→s1′: A (s5) →F(s1′), B(s5) →A(s1′) und so weiter).Wenn dieses Ereignis eintritt, gehen alle sechs RuvB-Untereinheiten gleichzeitig ohne weitere Änderungen an der Nukleotidanordnung in den nächsten Konformationscluster über (Untereinheiten in s5 und s1′ haben die gleiche Nukleotidbelegung), wodurch die Konformation des gesamten Hexamers in den Zustand s1 zurückgesetzt wird.Wir bezeichnen diesen Vorgang daher als „Cluster-Switch“ (s5→s1′) (Extended Data Abb. 8).Daraus folgt, dass alle nachfolgenden Prozesse nun in der jeweils benachbarten Untereinheit stattfinden, was impliziert, dass die Nukleotidhydrolyse und alle anderen Prozesse in wiederholten Sequenzen um den hexameren Ring herum ablaufen.Um strukturelle Einblicke in die Ereignisse zu erhalten, die an den Nukleotidbindungstaschen ablaufen, analysierten wir zunächst ihre gemeinsamen Merkmale.Nukleotide binden an der Schnittstelle zweier aufeinanderfolgender Untereinheiten (cis und trans), wobei das Nukleosid ausschließlich zwischen der RuvBS- und RuvBL-Domäne einer Untereinheit eingeklemmt ist35,40 (RuvB in cis) (Abb. 3f und Erweiterte Daten Abb. 9a, b).In allen ATP-enthaltenden Taschen bindet ein konserviertes Walker-A-Motiv den ATPγS-Mg2+-Komplex, in dem zuvor identifiziertes Lys65 mit dem ATP-γ-Phosphat41 interagiert und Thr66 das Mg2+-Ion koordiniert (Abb. 3f).Zusätzliche Kontakte werden durch zwei konservierte cis-wirkende Argininreste bereitgestellt: Arg21 und der Sensor 2 Arginin Arg21842.Arg21 befindet sich am N-Terminus und bindet das ATP-α-Phosphat, während Sensor 2 Arginin Arg218 in der kleinen ATPase-Domäne liegt und die Nukleotiderkennung vermittelt (Abb. 3f).In Übereinstimmung mit früheren Studien wird die ATPγS-Mg2+-Transsensorik durch zwei Elemente erreicht: ein konserviertes Signaturmotiv (Glu127–Asp130), das sich auf der α-Helix α4 befindet, und trans-wirkendes Arg171 auf der α-Helix α540,43 (Abb. 3f).Somit stellt Arg171 den kanonischen Argininfinger dar, der in den meisten AAA+-ATPasen konserviert ist und direkt das γ-Phosphat44 koordiniert.Darüber hinaus erkennen zwei zusätzliche saure trans-Reste, Glu128 und Asp129, die cis-Reste Arg21 bzw. Arg218 und stabilisieren somit indirekt die Nukleotidbindung (Fig. 3f).Um den molekularen Mechanismus und die Chemie der Kopplung von ATP-Hydrolyse und Signaltransduktion zu verstehen, verfolgten wir das Schicksal von ATPγS vor (s1), während (s2) und nach (s3–s5) der Hydrolyse in der Untereinheit A, deren Nukleotidbindungstaschen in trans liegen mit der von der DNA gelösten Untereinheit F. Während des Übergangs durch die katalytischen Zustände (s1→→s5) durchlaufen die Helices α4 und α5 der Untereinheit F eine konzertierte Bewegung, die unterschiedliche lokale Umlagerungen von trans-Resten ermöglicht, die für die ATP-Hydrolyse in der Untereinheit A entscheidend sind ( Abb. 3g).Insbesondere die intermolekulare Wechselwirkung zwischen trans-Glu128 und cis-Arg21, die im Zustand s1 aufrechterhalten wird, geht in den folgenden Zuständen verloren, sodass trans-Glu128 stattdessen mit dem kanonischen Argininfinger trans-Arg171 in Kontakt treten kann.Ferner verbindet sich im Zustand s2 der Rest trans-Tyr131 mit cis-Arg21 bei der Koordination von trans-Asp129, ein Ereignis, das mit dem Auftreten einer kontinuierlichen Dichte zwischen trans-Asp129 und dem ATPγS-Mg2+-Komplex zusammenfällt (Abb. 3h und Erweiterte Daten Abb. 9c ).Die Verbindungsdichte lässt sich am besten als geordnete Wassermoleküle beschreiben, die erforderlich sind, um den nukleophilen Angriff auf das ATP-γ-Phosphat zu erleichtern.Die Bedeutung dieses charakteristischen Motivs wurde durch Mutationsstudien hervorgehoben, in denen die Substitution von trans-Asp129 die Verzweigungsmigrationsaktivität deutlich beeinträchtigte und die Mutation von trans-Glu128 zu einem bakteriellen Wachstumsdefekt führte45.Als zusätzliche Validierung der in Untereinheit A von Zustand s2 stattfindenden ATP-Hydrolysereaktion ergibt sich auch eine Verbindungsdichte zwischen dem ATP-γ-Phosphat und dem Walker-B-Motivrest cis-Asp110, der ähnlich wie trans-Asp129 gezeigt wurde wichtig für die ATP-Hydrolyse45,46 (Abb. 3h und Erweiterte Daten Abb. 9a).In den nächsten Zuständen ist ein Fortschreiten der ATP-Hydrolysereaktion zu beobachten, die zunächst zur Freisetzung des γ-Phosphats führt (s2 → s3) (Abb. 3h und Extended Data Abb. 9a).Dadurch wird die Bindung von Sensor 2 cis-Arg218 an das Nukleotid gelöst, während die Koordination des Mg2+-Ions durch cis-Thr66 intakt bleibt (Abb. 3h und Extended Data Abb. 9a).Beim nächsten Übergang (s3→s4) setzt der Verlust des Mg2+-Ions cis-Thr66 frei, das nun das ADP-β-Phosphat koordiniert.Anschließend bewegt sich (s4→s5) cis-Arg218 von Sensor 2 von seiner eigenen Bindungstasche weg und grenzt die Untereinheit A ab, die für einen Clusterwechsel vorbereitet werden soll.Die Tatsache, dass wir eine spezifische Bindung von RuvAD3 an das RuvB-Hexamer gegenüber dem katalytischen Zentrum in Untereinheit A über alle Zustände (s1 bis s5) am unteren Ende der Treppe beobachtet haben, erklärt nicht eine Zunahme der ATPase-Aktivität in Gegenwart von RuvA9.Stattdessen legt es nahe, dass RuvAD3 in einer solchen Anordnung eine regulatorische Funktion auf den Nukleotidzyklus ausübt und direkt die Verzweigungsmigration koordiniert.Insbesondere fanden wir heraus, dass ein einzelnes RuvAD3 während aller fünf Zustände an die Untereinheit D gebunden ist, was zeigt, dass der RuvA-HJ-Komplex während des gesamten Nukleotidzyklus an beide gegenüberliegenden RuvB-Motoren in dreiteiligen Partikeln gebunden ist.Im Gegensatz dazu bindet ein zweites RuvAD3 ausschließlich an die Untereinheit E in den Zuständen s2 bis s5 (erweiterte Daten, Abb. 10a).Beide RuvAD3 binden an eine zuvor beschriebene hydrophobe zusammengesetzte Grenzfläche in ihren jeweiligen RuvB-Untereinheiten, die aus der RuvBL-α-Helix α3 und der Präsensor-1-β-Haarnadel15 zusammengesetzt ist (erweiterte Daten, Abb. 10b), die in anderen hexameren AAA+-Motoren des PS1 Superclade-Koordinaten mit ihren Substraten entweder direkt oder indirekt einfügen20,36,47.Die Analyse der Wirkung der RuvAD3-Rekrutierung (s1→s2) auf die Untereinheit E ergab, dass das Bindungsereignis eine keilartige Wirkung auf das RuvB-Hexamer ausübt, das die großen Domänen der Untereinheiten E und D auseinander treibt. Die Bewegung der Untereinheit E legt dies nahe Die RuvAD3-Bindung wird durch einen induzierten Anpassungsmechanismus erreicht (Abb. 4a, erweiterte Daten Abb. 10c und ergänzendes Video 3).Die Neupositionierung der Untereinheit E bewirkt eine gleichzeitige Verdrängung der großen ATPase-Domäne der Untereinheit D, die dann die Öffnung ihrer Nukleotidbindungstasche fördert und dadurch das Entweichen des ADP-Moleküls ermöglicht (Abb. 4b, Erweiterte Daten Abb. 10d und Ergänzung Videos 4 und 5).Unsere Daten zeigen also, dass RuvAD3 (Bindung an Untereinheit E) als Nukleotidaustauschfaktor fungiert, indem es auf Untereinheit D einwirkt. Bemerkenswert ist, dass die Neupositionierung von E gleichzeitig eine Bewegung der benachbarten, von der DNA getrennten Untereinheit F bewirkt, deren trans -wirkenden Reste Glu128, Asp129 und Arg171 erleichtern die ATP-Hydrolysereaktion in A wie oben beschrieben (Abb. 3g, h, erweiterte Daten Abb. 10e und ergänzende Videos 4 und 5).Auf der Grundlage dieser Beobachtung postulieren wir, dass RuvAD3 auch durch seine Bindung an die Präsensor-1-β-Haarnadel auf Untereinheit E als ATPase-aktivierende Domäne wirkt, die die ATP-Hydrolyse in A durch vorwärts koordinierte Signalübertragung zwischen den Untereinheiten stimuliert.a, Der RuvAD3-induzierte keilartige Effekt auf den Umrichter im RuvB-Motor.Die Farben entsprechen den Zuständen des Nukleotidzyklus (s1 und s2).Pfeile zeigen die Verdrängung der Domänenkerne von RuvBL (Untereinheit D) und RuvBL (Untereinheit E) durch die Bindung des zweiten RuvAD3 (grün).b,c, Langstreckensignalisierung zwischen Untereinheiten, ausgelöst durch RuvAD3-Bindung, verursacht Konformationsänderungen an Untereinheit D, die zur ADP-Freisetzung (s1→s2) (ADP grün) (b) und ATP-Aufnahme (s4→s5) (ATP rot) führen ( c).Während s1 bis s2 ermöglicht das Öffnen des Gates in der Untereinheit D die Freisetzung von ADP, während das Schließen des Gates während des Übergangs von s4 zu s5 mit der Aufnahme von ATP-Molekülen verbunden ist.Die Untereinheiten D, E und F sind in Cartoon-Ansicht gezeigt;Untereinheiten A, B und C in Oberflächenansicht gezeigt.d, Abstand zwischen cis-Arg21 und trans-Glu128 als Maß für Gate-Öffnungs- und Gate-Schließbewegungen des RuvB-N-Terminus während des Nukleotidzyklus.Die Toröffnung beginnt in Cluster [F], setzt sich in [E] fort und erreicht ihr Maximum in Cluster [D], was zur Freisetzung von ADP führt.AuflösungNukleinsäuren res.Nukleinsäuren res.Proz.Wissenschaft.Proz.Wissenschaft.J.Mol.Biol.J.Mol.Biol.AuflösungKommun.J.Mol.Biol.Biol.Biol.J.Mol.Biol.Biol.Biol.Proz.Wissenschaft.Proz.Wissenschaft.et al.Proz.Wissenschaft.Proz.Wissenschaft.Nat.J.Mol.Biol.Proz.Wissenschaft.J.Mol.Biol.Wissenschaft.Erw.Wissenschaft.Nat.Biol.Biol.Nukleinsäuren res.Artikel ADS-CAS Google ScholarBiol.Nat.Biol.Kommun.Biol.Nat.ProtokollProz.Wissenschaft.Nat.ProtokollNat.Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenJeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:Leider ist für diesen Artikel derzeit kein teilbarer Link verfügbar.Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedItDurch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich mit unseren Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einverstanden.Wenn Sie etwas missbräuchlich finden oder unseren Bedingungen oder Richtlinien nicht entsprechen, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.Melden Sie sich für den Nature Briefing-Newsletter an – was in der Wissenschaft wichtig ist, täglich kostenlos in Ihrem Posteingang.